İMMUNOHİSTOKİMYA

Renk Cümbüşünden Tek Renkli Bir Evrene
 

   Çoğu pozitif düşünce ve bilimsel eylemin başlangıcının ve evriminin belirlenmesinde yazılı kaynakların katkıları aranır. Yazılı kaynaklar Patolojinin başlangıcını eski Mısır uygarlığına götürmektedir.  Bu kaynakların en önemlileri papirüs üzerine yazılmış iki adet belgedir: Edwin Smith Papirüsü (İ.Ö.17.) ve Papyrus Ebers (İ.Ö.1550ler).
Arkeologların bir bölümü antik sitelerde buldukları iskeletlerde izledikleri patolojileri değerlendirme çabasına girmişler ve bu çabalar “Paleopatoloji” bilim dalının doğmasına yol açmıştır.
   Bodrum’un karşısındaki Kos (İstanköy) adasında yaşamış olan
Hippocrates’ın (İ.Ö. 460–370) tıp ve patoloji ile ilgili varsayımları günümüze dek etkili olmuştur.
   İlk otopsi ya da disseksiyon girişiminin Herophilos (İ.Ö.335–280) ve Erasistratos (İ.Ö. 304–250) tarafından İskenderiye’de (Mısır) yapıldığı belgelenmiştir.  300 yıl sonra Romalı
Cornelius Celsus “yangı (inflamasyon)” ile ilgili ilkelerini, Bergamalı Galen “kanser” olgusunu tanımlamıştır.    Hippocrates’ın etkisinde geçen yıllar 1270’e ulaştığında İtalya’da (Bologna Üniversitesi) anatomi-patolojik anatomi eğitimi amaçlı diseksiyonlara başlanmıştır. İlk patoloji kitabını İtalyan hekim
Antonio Benivieni(1443–1502) yazmıştır. Hastalıkları ilk kez sınıflandıran Jean Fernel (1497–1558) aslında bir matematikçi ve astronomdur.
   
Giovanni Batista Morgagni (1682–1771) ile öğrencisi Antonio Valsalva’nın (1666–1723) anatomi ve patolojiye önemli katkıları olmuştur. Patoloji 18. ve 19. yüzyılda Thomas Addison (1793–1860),  Thomas Hodgkin (1798–1866),  Carl von Rokitansky (1804–1878) ve Rokitansky’nin öğrencisi Rudolf Virchow (1821–1902) ile doruğa ulaştı.
   Bu dönemde morfolojik bilimlerde devrim yapacak bir buluş gerçekleşmişti:
mikroskop. İsa’dan önceki yıllarda içi suyla dolu bir borunun ucuna yerleştirdikleri mercekle yazıları ve cisimleri büyütmeye çalışan Çinlilerden önce eski Mısır’da suyun büyütme ve ışığı kırma niteliklerini bilen bilginler bunu işgalci Romalılara öğretmişlerdi bile. Optik fiziğinin gelişmesi ile ilk mikroskopun üretilmesi –çoğu bilim dalının evriminde olduğu gibi- yüzyıllarca süren çabaların ürünleridir. Optik fizikteki ilk adımları eski Mısır, eski Yunan ve eski Orta-Güney Amerika uygarlıklarının attıkları konusunda farklı görüşlerin varlığına karşın ilk yazılı belgenin Euclid’e (İ.Ö.300ler) ait olduğu bilinmektedir.
Mısır'da savaşan ataları Romalıların İskenderiye’den topladıkları bilgileri değerlendiren
Salvino D'Armate 1284 yılında merceklerden yararlanarak ilk gözlükleri üretti.
   
Claudius Ptolemy ışığın kırılmasını, Basralı Ibn-el-Haitham sferik ve parabolik aynaları, Salvino D'Armate ilk gözlük denemelerini, Johannes Kepler görme fizyolojisini ve görme kusurlarının mercekler kullanarak düzeltilmesinin ilkelerini, Galileo Galilei ilkel teleskopun geliştirilmesi çabalarını sürdürürken ilk mikroskop taslağı Hollandalı gözlükçü Zacharias Janssen ile ailesinden geldi (1590).  Gözlük üretimi yapan Hollandalı Janssenler –Çindeki çabalara benzer bir kurguyla- bir boru içine ve uçlarına mercekler yerleştirerek mikroskop kavramının ilk adımını attılar. 1609’da Galileo Galilei mikroskopta konkav ve konveks mercekler kullanarak büyük bir adım attı ve 1612 yılında geliştirdiği birkaç mikroskop örneği Avrupalı optikçilerin yoğun ilgisini çekti. 62 yıl boyunca süren çok sayıdaki deneme 1674’de -yine bir Hollandalı- Leeuwenhoek tarafından kurgulanan gerçek mikroskop düzeneği ile önemli bir gelişme gösterdi.  Üniversite eğitimi olmayan Antonie Philips van Leeuwenhoek oluşturduğu boru-mercek düzeneği ile bakterileri bile görülebilecek kadar büyütebilen sistemi geliştirip dünyaya duyurduğunda 42 yaşındaydı.  Bu aşama Anatomi’nin, Histoloji’nin, Mikrobiyoloji’nin ve Patoloji’nin dönüm noktası oldu.
   Antonie Philips van Leeuwenhoek’un ilk mikroskopu kullanmasından 200 yıl kadar sonra Çanakkale’nin Hisarlık yöresindeki Truva, Agememnon’un askerlerinin bile yapmadığı kadar yıkılarak Priamos hazinesi yağma edildi. Kimilerinin hayranlık duyduğu ve arkeolojinin kurucusu olarak nitelendirdiği Heinrich Schliemann patlayıcı kullanarak yıktığı surlarda bulduğu hazineyi önce Yunanistan’a oradan da Almanya’ya kaçırdı. 1867 yılında Paris’teki bir sanat sergisine davet edilen zamanın Osmanlı Sultanı Abdülaziz bu geziden dönüşünde Almanya’ya da uğramış, belki de Berlin’de Heinrich Schliemann  ve
Dr. Rudolf Ludwig Carl Virchow ile tanışarak Truva kazıları için söz vermişti. 1870 yılında Dr.Virchow ile birlikte İstanbul’a gelerek yazılı kazı onayı alan Schliemann 1873 yılı Mayıs ayında, gerçekte kendisinden 15 yıl önce Hisarlık surlarına ulaşmış olan İngiliz arkeolog Frank Calvers’in anılarını okumuş ve çok iyi kavramıştı. Yeni bulunmuş bir patlayıcı olan dinamitle geldiği surları patlatarak çağının en büyük soygunlarından birini gerçekleştirdi.
   Truva duvarlarının dinamitlendiği yıllarda antropolojiyle de ilgilenen, siyaset alanında Bismarck ile kapışan bir hekim olarak gördüğümüz
Virchow “modern patolojinin kurucusu” olarak bilinir. 1846’da başladığı Patoloji asistanlığı döneminde Prusya’daki salgın hastalıkların nedeninin yoksulluk olduğunu görünce devrimcilerin yanında saf tutmuştur.  Çoğu devrimci aydın gibi Berlin’den kaçan Virchow Würzburg Üniversitesi’ndeki çalışmaları ile “hücre patolojisi” ve “modern patoloji” kavramlarının temelini atmıştır. Araştırmalarını gören ilgililerin onu yeniden Berlin’e çağırması üzerine 1856’da Berlin Üniversitesi’nde kurulan Patoloji Enstitüsü’nün başına geçmiş, ölene dek patoloji, antropoloji ve siyaset üçgeninin köşeleri arasında mekik dokumuştur.
Virchow, bir süre önce
Theodore Schwann (1810-1882)’ın başlattığı  “hücre” kavramı üzerine kurduğu “hücre patolojisi” kuramını tanımlarken canlı organizmadaki tüm aksamaları -çağdaşı Karl Marx’ın etkisinde de kalarak-  “hücrelerarası olumsuz etkileşimlerin sonucu” olarak nitelemiş; Omnis cellula e cellula (her hücre başka bir hücreden kökenlidir) derken günümüzdeki “kök hücre” ile “rejenerasyon” ve “tümör” patogenezinin temellerini atmıştı. Patoloji deneyimlerini klinik gözlemlere, hayvanlar üzerinde yapılan deneylere, özellikle de doku ve hücre düzeyindeki mikroskop incelemelerine borçlu olan, yangı (inflamasyon) olgusunu ve tümör oluşumunu titizlikle araştıran Virchow  “infeksiyon” kuramına asla inanmamış, Pasteur’ün “canlı etkenlerin insan organizması üzerindeki etkileri” konulu konferansının bitiminde meslektaşını kutlamadan öfkeyle ayrılmıştı salondan.
   
Johannes Purkinje (1787-1869)’nin mikrotom işlevi gören araçları kullanıma sunmasıyla birlikte hücreler, dokular ve organlar ile ilgili bilgiler sel gibi akmaya başladı: göz sinirleri ve gözdeki Schlemm kanalı (Friedrich Schlemm); kemiklerdeki Volkmann kanalları ve sempatik sinir sistemi (Alfred Wilhelm Volkmann); sinir sistemi ve duyular, kadın genital sistemindeki Müller kanalı, endokrin sistem (Johannes Peter Müller); kemiklerdeki Sharpey lifleri ve epitel hücrelerinin siliaları (William Sharpey); lenfatik sistem, kıllar, mucus, irin, epitel türleri, böbrekteki Henle kulpu (Friederich G. J. Henle); hücre/doku ilişkisi, Schwann hücreleri (Theodore Schwann); derideki Vater-Pacini cisimcikleri, Vibrio cholera (Filippo Pacini); böbrekte glomerüllerin Bowman membranı, gözde korneanın Bowman membranı, burun mukozasındaki Bowman bezleri (Sir William Bowman); timustaki Hassall cisimcikleri, gözde Hassall-Henle cisimcikleri (Arthur Hill Hassall); retinadaki nöroglial Müller lifleri, corpus ciliare (Heinrich Müller) başlıca örnekler olarak verilebilir.  1887’de Prens Frederick’e yapılan larinks biyopsisinden mikrotom kullanılarak hazırlanan kesitlerin mikroskopla incelenmesi Cerrahi patolojinin ilk uygulamasıdır; kesitler Virchow tarafından incelenerek rapor edilmiştir.


İMMUNOHİSTOKİMYA
   Mikroskop büyük aşamalar gösterirken 1825’de François-Vincent Raspail ile başlayan histokimya Virchow’un 1856’da Berlin Üniversitesi Patoloji Enstitüsü’nde çalışmaya başladığı yıllarda büyük ataklar yapmıştı. 20.yüzyıla gelindiğinde konuyla ilgili çok sayıda yayın vardı. Mikroskop karşısına geçen morfologlar çok renkli bir dünyada gezinirken her ay yeni bir yöntemle yeni hücreler ve ürünleri tanımlanıyordu.
   Deneysel araştırmalar, hücreleri ve dokuların ürettiği kimyasal maddeler ile bunların birbirleri üzerindeki etkileri moleküler biyolojinin ve moleküler patolojinin doğmasına yol açtı.
   Temel Bilimler’in önemli bir dalı olan Moleküler Biyoloji geliştikçe Moleküler Patoloji’nin de adımları hızlanıyordu. Tetiği ilk çeken Marrack oldu; kan proteinlerinden tifüs ve kolera etkenlerine karşı oluşmuş antikorları elde etti. Antikorları benzidin tetraedro ile işaretleyerek bağlandıkları antijenleri kırmızı renge boyadı.
   Bir Patolog ve İmmunolog olan
Prof. Coons  immunohistokimyanın üç temel bilgiyi içerdiğini gördü: immunoloji, histoloji, kimya. Kimyadaki en basit ilke immunohistokimyanın da temel ilkesiydi: antijen + antikor = antijen-antikor kompleksi (immun kompleks). Bu süreci iyi kavrayan Coons benzer bir mantıkla Pnömokoklara karşı oluşmuş antikorları floresan veren bir madde olan anthracene isocyanate ile işaretleyerek bakterilerin özel mikroskopla görülebilmesini sağladı. Bu ilke günümüzde de immunofloresan mikroskopinin temel ilkesiydi. 

   İmmunofloresans tekniğinin dondurulmuş taze dokulardan elde edilen kesitlere uygulanabilmesi immunohistokimya çalışmalarının en önemli engeliydi. Bu engeli aşmaya yönelik çabalar 1966 yılında dünyanın iki farklı yöresinden geldi; Avrameas ve Uriel  ile Nakane ve Pierce antijen-antikor komplekslerinin başka yöntemlerle de görülebileceğini kanıtladılar. Çok geçmeden peroksidaze-antiperoksidaze (PAP) tekniklerinin ilk filizleri belirdi; önce Nakane, bir yıl sonra da Mason ve ark, Sternberger ve ark, Mason ve Sammons. Birkaç yıl sonra da “alkalin fosfataze ve monoklonal anti-alkalin fosfataze (APAAP)” gibi gelişmiş teknikler sunuldu.
   Enzimlerden yararlanarak östrojen reseptörlerini belirleyebilen Aasmundstad ve ark immunohistokimyada yeni kapılar açtılar.

   İmmunohistokimya yöntemleri geliştikçe istenilen yapıları uygun antikorlarla görebilmenin niteliği de artmaktaydı.  Bu dönemde Avidin-Biotin uygulamalarının sağanağı başladı.
   Nitelik geliştirme çabaları arasında frozen kesitlerine dönme çabaları ve fiksasyonlarla ilgili kuşkular öne çıktı, yeni teknikler önerildi.  Ancak nitelik uzun süre yetersiz kaldı. Çok nitelikli renk dağılımı saptanan kesitlerde pozitif ya da negatif boyanmaların niceliklerini de bilmek gerekiyordu.  Araştırmacıların bir bölümü niceliksel ölçütlerin belirlenmesi ve standardizasyonu, belirlenen ilkelere uygun bilgisayar desteğinin geliştirilmesi ve görüntü analizi programlarının oluşturulması çabalarına giriştiler.
   Standardizasyonu etkileyen bir başka etken “teknik personel” ile ilgiliydi. Tekniker kusurlarını ortadan kaldırmaya yönelik uğraşlar (robotik laboratuvar önerileri ve çalışmaları) immunohistokimya laboratuvar tekniklerinin büyük bir gelişme gösterdiği 1980-1990 arasında yoğunlaştı.  Günümüzde immunohistokimya laboratuvarlarının yaygın olarak kullanıldığı robotik sistemleri üreten firmalar arasındaki kıyasıya savaş ve rekabet giderek artmaktadır.
İmmunohistokimyada ilk girişimler infeksiyon hastalıklarının etkenlerini belirlemek amacına yönelikti.
   Günümüzdeki immunohistokimya yöntemleriyle çok sayıda araştırma ve inceleme yapılabilmektedir:
(a) Canlı etkenlerin belirlenmesi: H.pylori, T.pallidum, H.capsulatum, virüsler (HHV1, HHV2, CVM, HHV8),  parazitler (T.gondii, P. jiroveci) ile kimi mikobakteriler,
(b) Nöropatoloji: dejeneratif beyin hastalıkları ile distrofik kas hastalıklarının tanısı ve izlenmesinde de önemli katkılar sağlamaktadır.
(c) Sitolojik materyalin incelenmesi: immunositokimya,
(d) Deneysel araştırmalar,
(e) Yangı (inflamasyon): yangı hücreleri, medyatörler, vb,
(f) Reseptörler: östrojen, androjen, vd,
(g) Hücre siklusu: apoptozis, vb,
(h) Tümörlerin tanısı ve izlenmesi.

 

TÜMÖR MARKERLERİ
 

İmmunohistokimyanın en önemli atılımlarından biri “tümör markerleri”nin bulunmasıyla gerçekleşti.  Onkolojik patolojiye özgü markerlerin nitelikleri, tümör hücrelerinin kaynaklandıkları ya da taklit ettikleri normal hücrelerin içerikleri ya da ürettikleri maddelerin niteliklerinden farksızdır, farklılık niceliktedir. Markerlerin çoğu protein niteliğindedir. Gen mutasyonlarının belirteci olan markerler ise genlerin ya da DNA yapısındaki değişmelerin belirlenmesi ilkesine dayanır (genomik markerler). Enzimler, onkogenler, tümörlere özgü antijenler, proliferasyon markerleri ve tümör süpressör genleri immunohistokimyasal yöntemlerle gösterebildiğimiz tümör markerlerinin başlıcalarıdır.
 

Onkolojik patolojideki uygulamaların çok önemli yararları vardır:
   1- İndiferansiye tümörlerin tanısı kolaylaşır;
   2- Tümörlerin sınıflandırılması kolaylaşır (örneğin lenfomalar gibi kimi tümörler alt gruplara ayrıldığında daha özgün tedaviler uygulanabilmekte);
   3- Klinikte primeri saptanamayan metastazların primeri belirlenebilir;
   4- Tümör tedavisinde uygulanacak yöntem, tedaviye yanıt ve prognoz izlenebilir;
   5- Tümörlerin agresyon potansiyeli saptanır.

 

Patolojide markerleri genellikle dokularda ararız. Klinikte ise kan, idrar, dışkı, viseral boşluklardaki sıvılarda belirlemeye çalışılır. Serolojik yöntemlerle saptanan markerler, tümör tanısı için yapılan biyopsilerden alınan doku örneklerindeki markerlerin yerini dolduramaz. Histopatolojik olarak tümör/kanser tanısı konulmamış olgulardaki kan, idrar, dışkı, vb markerler ancak bir uyarı olarak algılanır. Serolojik yöntemlerle incelenen markerler biyopsi ile tanısı konulmuş bir kanser olgusunda, uygulanan tedavi yönteminin başarısını ve prognozu izlemekte yardımcı olabilmektedir.
Prens Frederick’e yapılan larinks biyopsisi ile başlayan cerrahi patolojinin ilk uygulamasından bugüne dek özellikle tümör immunohistokimyasına özel bir önem verilmiştir. Meme kanseri, akciğer kanseri, prostat kanseri, lenfomalar, beyin tümörleri gibi olgular ile ilgili araştırmalarla ilgili sunumlar bilimsel dergilerin ve toplantıların ana konuları olma önceliğini sürdürmektedir.

 

ORAL MUKOZANIN PREKANSERÖZ LEZYONLARINDA ve SKUAMÖZ HÜCRELİ KARSİNOMLARINDA UYGULANAN MARKERLER


Moleküler patoloji ve diagnostik genetik çalışmalarında kullanılan çeşitli tekniklere her geçen gün bir yenisi eklenirken oral patoloji uygulamalarında 4 temel amaç izlenir;

(a) Prekanseröz mukoza lezyonlarında invazif nitelik kazanma eğiliminin önceden belirlenebilmesi,
(b) İndiferansiye tümörlerde ayırıcı tanı yapabilmek,
(c) Cerrahi yöntemlerle çıkarılmış prekanseröz ve kanseröz lezyonların prognozuyla ilgili ipuçları elde etmek,
(d) Çene kemiklerine metastaz yapmış tümörlerin primerini belirlemek.
Örneğin, her an patlamaya hazır bir bomba gibi görülen in situ karsinomlardaki (CIS) ve ileri düzey epitel displazilerindeki olası davranış değişikliğini belirlemek amacıyla çok sayıda immunohistokimya paneli uygulanır. Ayrıca rezeksiyon sınırlarında pozitif boyanma saptanan olgularda bir süre sonra residiv meydana geleceği öngörülür.

Baş-Boyun Patolojisi Çalışma Kümesi’nde tümörlere uygulanan panellerin içeriğinde kullanılan antikorların bir bölümü ağız mukozası lezyonları için de kullanılmaktadır.
 1. Genomik markerler
DNA'daki, kromozomlardaki, onkogenlerdeki ve tümör süpressör genlerindeki değişikliklerin saptanmasında kullanılırlar.
1.1. DNA aneuploidy: Bir hücredeki DNA içeriğinin değişmesi, o hücrenin genetik davranışlarının değişmesi anlamına gelir. Normal hücreler -DNA içeriği de normal olduğu için- genetik açıdan duragan (stabil) hücrelerdir. Buna karşın kanser hücreleri -DNA içeriğinin değişmesi nedeniyle- genetik açıdan değişken (labil) bir nitelik kazanır.
Ağız mukozasının skuamöz hücreli karsinomlarında "flow cytometry" ve "image cytometry" yöntemleriyle DNA içeriği belirlenerek hastalığın prognozu ile ilgili verilere ulaşılır. Örneğin, DNA içeriği normal olan lezyonlarda kanserleşme riskinin az, aberan DNA içeriği bulunanlarda ise yüksek olduğu belirlenmiştir. Bu yöntem, invazif karsinoma değişme eğilimi gösteren prekanseröz lezyonların prognozunu önceden kestirebilmekte yararlı olmaktadır.
Klinik uygulamada insizyon biyopsisi yapmadan, fırça (brush) ya da yüzey kazıması yöntemleriyle alınan örneklerdeki başarı oranının %97’nin üzerinde bulunması önemli bir kazanımdır.
1.2. Heterozigositenin yitirilmesi: bir kromozom çiftindeki genomik materyallerden birinin yitirilmesidir. Kromozomlardaki heterozigositenin yitirilmesi tümör süppressör genlerinde olumsuzluklara ve inaktivasyona neden olmaktadır. İnsan organizmasındaki kanserlerin çoğu tümör süpressör genlerindeki bozuklukların sonucudur. Kromozomların 3p, 4q, 8p, 9p, 13q ve 18 q kollarının yitirilmesi oral prekanseröz ve kanseröz lezyonların oluşmasına yol açabilmektedir. Prekanseröz lezyonlarda heterozigosite yitirilmesi kanserleşme eğiliminin erken belirtisi olarak kabul edilir; 3p ve 9p kollarının yitirilmesi, kromozomların öteki kollarından herhangi birinin yitirilmesine oranla yaklaşık 4 katı daha fazla etkindir. 3p, 4q ve 9p kollarına ek olarak başka bir lokusun da yitirilmesi kanserleşme olasılığını 33 kat arttırmaktadır. 3p, 4q ve 9p kollarının yitirilmesi özellikle ağız tabanı, dil kenarları ve yumuşak damak karsinomlarında sık rastlanan bulgulardandır. 4q kolunun yitirildiği olgularda tümörün daha progressif geliştiği gözlenir.
1.3. p53 (P53): hücrelerin proliferasyonunu denetleyen, otonomi eğilimi gösteren hücrelerin ortadan kaldırılmasını ve böylece tümör oluşumunu engelleyen bir TP53 ailesine özgü bir gendir (tümör geni). Bu genin kodladığı protein (p53 proteini) öncelikle hücrelerin genetik yapısını etkileyebilecek zararları önler ve hücredeki genetik yapı bozukluklarını düzeltme çabası gösterir. Yapı bozukluklarını düzeltme çabası yetersiz kalırsa genetik yapısı bozulan hücrenin ortadan kaldırılmasına çabalar. p53 proteini niceliği normal hücrelerde ve displastik epitel hücrelerinde immunohistokimya yöntemleriyle gösterilemeyecek kadar azdır. p53 artışı (mutasyon) prekanseröz lezyonlardaki kanserleşme eğiliminin erken bulgularındandır.
Mutasyona uğrayan p53 proteini tümör hücrelerini etkileyebilme gücünü yitirir. Kanserli dokularda mutasyonlu p53 yığılması immunohistokimya yöntemleri ile kolayca gösterilebilen ve ayırıcı tanı yöntemi olarak kullanılan değişikliklerden biridir.
Eritroplakilerde ve skuamöz hücreli karsinomların erken evresinde mukozanın parabazal hücrelerinde p53 yığılması saptanır.
Dokularda mutasyona uğramış p53 proteininin gösterilmesi önemli bir histopatolojik bulgu olsa da tek başına değerlendirilmemeli, ayırıcı tanıda yararlı başka yöntemlerle birlikte uygulanmalıdır.
Ağız mukozasının skuamöz hücreli karsinomlarında p53'ün Ki-67 ile birlikte pozitif olması tümörün progresyonu, histolojik grade'i ve metastaz eğilimi ile uyumludur.
Yaşlılarda ağız mukozası p53 düzeyleri artar.
1.4. p63: p53 gibi TP53 ailesinin bir başka üyesi olan p63 proteini ile ilgili araştırmaların sonuçları da prekanseröz lezyonların kanserleşme eğilimi konusunda bilgi verebilir. Normal epitelin bazal hücrelerinde saptanan p63, displastik değişiklikler gösteren olgularda parabazal ve spinal hücrelerde de bulunur. Ağır displazilerde displazinin olduğu her kesimde, CIS olgularında ise tüm katmanlarda pozitif boyanma izlenir, özgün bir anlamı yoktur.
   

   2.Diferansiyasyon markerleri (ABO)
Prekanseröz ve kanseröz hücrelerdeki diferansiyasyon düzeyinin belirlenmesinde kullanılan yüzey antijenleri ve keratin belirteçleridir.
2.1. Yüzey antijen markerleri: hücre yüzeylerine bulunan, kan grupları ile doku gruplarını belirleyen antijenlerdir (doku-kan grupları antijenleri, ABO antijenleri, Lewis ve T/Tn sistemleri ). Bu tür antijenler ağız mukozasındaki çok katlı yassı epitel hücrelerinin yüzeylerinde de bulunurlar. Kanserleşme eğilimi gösteren epitel hücrelerinde diferansiyasyon yetersiz olduğu için yüzey antijenlerinin sentezi de bozulur. Sentezi bozulan yüzey antijenleri ya tümüyle kaybolur ya da bulunmamaları gereken hücrelerin yüzeylerine saptanırlar. İmmunohistokimya teknikleri prekanseröz ve kanseröz lezyonların çok erken dönemlerinde saptanan yüzey antijeni bozukluklarının belirlenmesinde kullanılır. Örneğin, prekanseröz bir lezyonun hücrelerindeki doku-kan grubu A antijeninin yokluğu, kanserleşmenin çok önemli bir habercisidir. Kanser hücrelerindeki doku-kan grubu A ve B antijenlerinin yokluğu ise, tümördeki güçlü invazyon yeteneğinin ve kötü prognozun göstergesidir.
2.2. Keratin markerleri (sitokeratinler): displastik lezyonlardaki diferansiyasyon bozukluklarını gösteren belirteçlerden biridir. Monoklonal ve poliklonal keratin antikorlarının kullanıldığı boyama teknikleri skuamöz hücreli karsinomların belirlenmesinde önemli bir yer tutar. Özellikle monoklonal antikorlarla boyanan skuamöz hücreli karsinomlarda keratin proteinlerinin dağılımındaki düzensizlik patognomonik bir bulgudur.
Keratin skuamöz (çok katlı yassı) epitel hücrelerinin hücre iskeletini oluşturan proteinlerdendir (cytokeratin). Bilinen 20 adet keratin vardır (CK1-CK20). Malign değişmelerle birlikte hücre iskeletinde bulunan keratin proteinlerinin tipinde ve dağılımında değişiklikler saptanır. Normal koşullarda bazal tabaka hücrelerinde bulunan CK5/CK14 ikilisi displastik değişiklikler gösteren epitelde parabazal ve spinal hücrelerde saptanır. Spinal hücrelerde ve keratinleşme alanlarında bulunan CK4/CK13 ile CK1/CK10 ikilileri ileri displazilerde tümüyle kaybolurlar. CK8/CK18 ikilisi displastik değişikliklerin bulunduğu alanlarda pozitif sonuç verebilir. CK19 normal epitelin bazal tabaka hücrelerinde görülürken orta-ileri derecede displazilerde ve CIS'da bazal tabakanın yanı sıra suprabazal hücrelerde de pozitif sonuç verir. Hücre pleomorfizmi arttıkça tümör hücrelerindeki CK19 niceliğinin de arttığı görülür. İlginç olan, CK19' un gingivitisli bölgelerdeki dişeti epitelinde diffuz bir dağılım göstermesidir.
Bir başka bulgu CK4, CK13, CK1 ve CK10 gibi diferansiyasyon belirteçlerinden yararlanarak grading yapılabileceğidir. Ağır epitel displazilerinde ve az diferansiye tümör hücrelerindeki yoğun boyanmalar, hücrelerdeki diferansiyasyon ve matürasyon bozulmasının göstergesidir.

 

   3. Proliferasyon markerleri (Kİ67)
Epitel hücrelerindeki çoğalma hızının saptanmasında kullanılan belirteçler-dir. Hücre siklusunu kontrol eden siklinler (cyclin) ile kinase enzimleri (CDK) hücrelerin gereğinden fazla çoğalmalarını engeller. Genetik yapısı bozulan hücrelerin proliferasyonu kontrol edilemez. p53 proteini ile ilgili olan p21 sikline bağlı kinaze inhibitörlerinden biridir; p21 düzeyi arttıkça tümörün büyümesi hızlanır, agresyonu artar, prognoz kötüleşir. Histokimyasal yöntemlerle incelenen prekanseröz lezyonlardaki Cyclin (cyclin D-1) ve CDK düzeylerindeki azalma kanserleşme eğiliminin göstergelerinden biridir.
Ki-67 gibi bir progresyon belirteciyle birlikte uygulanarak yapılan değerlendirmelerin sonuçları lezyonun prognozuyla ilgili mikroskopik yorumların daha kolay yapılabilmesini sağlar.

 

   4. Progresyon markerleri
Genellikle tümörlerde bulunan ve bir tümörün progresyonuyla ilgili ipuçları veren maddelerdir.
Survivin birçok tümörde bulunan bir apoptozis inhibitörüdür. Ağız mukozası-nın prekanseröz lezyonlarında survivin saptanması invazif karsinoma dönüşme eğiliminin erken belirtisidir. İnvazif karsinomların tümünde survivin pozitiftir.

Ağız kanserlerinin progresyonunda hücre proliferasyonundaki artış kadar apoptozis düzeninin bozulması da etkilidir; apoptozis süpresyonunu (bcl-2) ve diferansiyasyonu (pozitif Ki-67) belirlemede yardımcı olan teknikleri değerlendirmek progresyonu belirleme çabalarına yardımcı yöntemlerdir.
Tumor growth factor (TGF), tümör progresyon belirteçlerine bir başka örnektir, Skuamöz hücreli karsinom niteliği kazanmış olgularda, özellikle periferik kesimlerindeki güçlü TGF-alpha varlığı tümörün agresyonu ile ilgili ipuçları verebilir.

CD44v9 niceliğindeki azalma skuamöz hücreli karsinomların lenfatik yolla metastaz yapma eğilimini belirlemede kullanılan bir belirteçtir.
MUC1 tümörlerde bulunan, müsine benzer özellikler taşıyan glikoproteindir. Ağız mukozası lezyonlarında MUC1 bulunması prekanseröz ve kanseröz lezyonların varlığını gösterir. Skuamöz hücreli karsinomlarındaki hücre membranına özgü MUC1 niceliği arttıkça, tümörün invazyon ve metastaz gücünün de arttığı belirlenmiştir.

İncelenen kesitlerde CXCL13 (chemokine ligand-13) saptanması kemik invazyonu ve osteolizis belirteci olarak anlamlıdır.

Hücre proliferasyonlarında, diferansiyasyonunda ve apoptozis sürecinde önemli işlevleri olan mikroRNA’lar (miRNA)  son yıllarda kimi kanserlerin prognoz ve agresyon belirteci olarak önemli katkılar sağlamaktadır. Oral skuamöz hücreli kanserlerde miR-21 öne çıkar, miR-205 ise skuamöz hücreli malign olgularda olduğu kadar benign olgularda da pozitiftir.
 

   5. Adhezyon markerleri
Moesin, aktin filamentlerini hücre yüzeyine bağlayarak hücrelerin birbirine yapışmalarını sağlayan bir yüzey komponentidir. Normal ağız mukozasında ve deride sağlıklı bazal ve spinal hücrelerin yüzeyini kuşatır. Displastik değişiklikler gösteren epitel hücrelerinin yüzeylerindeki moesin niceliği stratum corneum katmanına yaklaştıkça azalır. Skuamöz hücreli karsinom hücrelerindeki moesin yerleşimi intrasitoplazmik nitelik gösterir, hücre yüzeylerinde yoktur. Bu nitelik tümör hücreleri arasındaki bağlantı yetersizliğinin en önemli nedenlerinden biridir.

 

   6. Angiogenezis markerleri
Angiogenezis kapiller damarların yerel proliferasyona bağlı damarlanma artışı olgusudur. Kanserlerin büyük bir bölümünde angiogenezisi uyaran

G-CSFR (granulocyte-stimulating factor receptor), VEGF (vascular endothelium growth factor) ve PD-ECGF (platelet-derived endothelial cell growth factor) gibi çeşitli faktörlerin üretildiği saptanır.  Etkin faktörlerin gücü oranında tümör çevresindeki damarlanma artar.  Başlangıçta periferik alanlarda beliren damar artışı tümör büyüdükçe kitlenin içlerine dek ilerler. Yeni oluşan kapillerlerin kimi segmentlerinde lümenleri tümör hücrelerinin döşediği saptanır.
Epitelyal displazilerde ve skuamöz hücreli karsinomlarda özellikle G-CSFR'nin varlığı saptanır. G-CSFR'nin yoğunlaştığı bölgelerde, endotel hücrelerine özgü bir glikoprotein olan CD34 ile prolifere olan hücrelerdeki çekirdek antijeninin (PCNA) varlığı güçlü angiogenezisin belirteci olarak kabul edilmektedir.
Endotel yüzey adhezyon molekülleri (CD31, CD13/APN) ve hücre yüzey proteinleri (integrin) ile yapılan araştırmalarda displastik değişiklik gösteren hücrelerin progresyonu ile ilgili önemli ipuçları belirlenmiştir.
Tümör angiogenezisinde mast hücrelerinin de önemli etkisi bulunur; intratümöral mast hücresi yoğunluğu angiogenezisin ve invazif karsinoma dönüşme eğiliminin önemli bir bulgusu olarak kabul edilmektedir. Tümörü kuşatan alanlardaki mast hücresi yoğunluğu ise bağ dokusu yıkımının ve invazyon gücündeki artışın göstergesidir.
IL-8 akut yangılarda nötrofil kemotaksisine ve endotel proliferasyonuna neden olan bir sitokindir. Skuamöz hücreli karsinomlarda (özellikle en agressif kesimlerinde) tümör hücrelerinin ürettiği güçlü IL-8 varlığı saptanır. Tümör hücrelerinden kökenli IL-8 vasküler proliferasyonu hızlandıran bir başka faktördür. İnfiltrasyon alanlarındaki fibrin niceliği arttıkça tümör hücrelerinin daha fazla IL-8 ürettiği saptanmıştır.
Lenf damarlarının proliferasyonu (lenfangiogenezis) tümör hücrelerinin lenfojen yayılmasını kolaylaştırması nedeniyle kan damarlarının proliferasyonu kadar önemlidir. Tümörde ve lenfatiklerin endotel hücrelerinde saptanan VEGF-C (vascular endothelium growth factor) lenfangiogenezisi uyaran önemli bir faktördür. Lenf damarlarının proliferasyonu tümörün periferik kesimlerinde daha belirgindir.

 

ODONTOGEN KİSTLER ve TÜMÖRLERDE UYGULANAN MARKERLER
 

Odontogen kistlerin ve odontogen tümörlerin immunohistokimyasal açıdan incelenmelerinde kullanılan tekniklerin ve panellerin çok büyük bir bölümü oral mukoza tümörlerinin incelenmesi için uygulananlardan önemli farklılıklar göstermez.
 

CD 31, CD34, CD105, VEGF, INOS, Ki67 gibi çeşitli angiogenezis ve proliferasyon faktörlerinin yanı sıra Enamelizin ve benzeri matriks metalloproteinazeler ile Laminin ve Enamelin olarak nitelendirilen organik matriks proteinlerinin odontogen kistlerde ve tümörlerde büyüme eğilimi ve agresyon belirteci olarak izlenebileceği görülmektedir.
 

Bu bölümde aktardığımız bilgilerin yetersizliği odontogen kistlerin ve odontogen tümörlerin immunohistokimyasal ve moleküler nitelikleri ile ilgili doldurulması gereken çok büyük boşluklar olduğunun kanıtıdır. Tümörler konusuna önemli kaynaklardan biri olan Dünya Sağlık Örgütü (WHO) “International Agency for Research on Cancer” çalışma grubunun 2005 yılı yayınında bile odontogen tümörler ile ilgili immunohistokimya ve moleküler patoloji verilerinin yetersizliği dikkati çekmektedir.

…ve SONUÇ
   Bu bir devrimdi; konvansiyonel boyama yöntemlerindeki renkli dünyanın yansımalarını ortadan kaldıran ve “kahverenginin egemenliği” ile sonlanan bir devrim. Bu devrimi Türkiye’ye getirenler ve ilk çalışmaları yapanlarla ilgili yazılı bilgilere ulaşamadık. Ancak, bu devrimin başlangıcı olan “immunofloresans mikroskopi” tekniğinin İstanbul’daki ilk uygulamalarının 1970li yılların sonlarına doğru İ.Ü. İstanbul Tıp Fakültesi Dermatoloji Kürsüsü’nden Prof.Dr. Türkan Saylan’ın ve Dişhekimliği Fakültesi Patoloji Kürsüsü'nden Prof.Dr. Melih Tahsinoğlu’nun WHO desteği ile kurdukları laboratuvarda başladığını biliyoruz. Bu laboratuvarda Lepra hastalarıyla ilgili araştırmaların yanı sıra İ.Ü. İstanbul Tıp Fakültesi Nefroloji (Prof.Dr. N.Koçak), Nöroloji (Prof.Dr. C.Özdemir), Romatoloji (Doç.Dr. M.Koniçe) hastalarından alınan biyopsilerin incelenmesi yapılıyordu.
   İmmunohistokimya alanında 1980’de başlayan yayın patlaması 21.yüzyılın ilk 5 yılında 95.000 çalışmanın yayınlanmasıyla tepe noktasına ulaştı. İzlenmesi olanaksız yeni yeni dergilerde yüzlerce yeni marker, yöntem modifikasyonları, robotlarla uygulanan yeni teknikler öneren binlerce yayın. Yaşamının önemli bir bölümünü mikroskop karşısında geçirenlerin saatlerce inceledikleri hücreler ve oluşturdukları kümelerden tanıya gitmekte çektikleri zorlukların büyük bölümünü gideren bir teknoloji.
Önümüzdeki birkaç yıl içinde gelmesi beklenen bilgisayar destekli mikroskopi teknikleri gerçekleştiğinde, örneğin, pozitif boyanan hücre oranını belirleyerek bir tümördeki proliferasyon hızını, metastaz gücünü ve prognoz olasılıklarını saptayacak, belki de tedavi protokolü bile önerilebilecek sistemlerle çalışılacaktır. Bu aşamada klinik patolojinin yönünü klinik onkopatolojiye çevirmesi kaçınılmaz olacaktır.
İmmunohistokimya laboratuvarı robot teknolojisini ayaklarımıza getiren üretici firmaların birbirleriyle olan kıyasıya savaşı
”robot mikroskop teknolojisini” ile sürecek gibi görünmektedir.

 

Esen kalın...

Bu bölümün kaynakları için >>>>>